ФЛАВОЦИТОХРОМУ b2 ІЗ КЛІТИН НАДПРОДУЦЕНТА OGATAEA POLYMORРHA «tr1» (gcr1 catX CYB2)

O. Smutok, M. Karkovska, N. Stasyuk, M. Gonchar

Анотація


Опрацьовано новий метод виділення, очищення та стабілізації L-лактат: цитохром с оксидоредуктази (КФ 1.1.2.3; флавоцитохром b2, ФЦ b2) із клітин рекомбінантного штаму дріжджів Ogataea (Hansenula) polymorpha «tr1» (gcr1 catX CYB2) та досліджено фізико-хімічні властивості очищених препаратів ферменту. Штам характеризується порушенням глюкозної катаболітної репресії та п’ятикратним надсинтезом ФЦ b2, порівняно із батьківським штамом дикого типу. Для забезпечення максимального виходу мембранозв’язаного ФЦ b2 досліджено вплив низки детергентів і оптимізовано умови виділення ферменту. Для очищення ФЦ b2 розроблено новий метод афінної хроматографії, який ґрунтується на використанні цитохрому с як природного ліганда, іммобілізованого на амінопропілсилохромі. Ефективність розробленого методу афінної хроматографії було порівняно з іонообмінною хроматографією на DЕАЕ–Toyopearl 650M целюлозі. За використання обох типів хроматографії питома активність ФЦ b2 у ферментних препаратах становила 10 Од.·мг-1, а вихід очищеного ферменту коливався в межах 75–95 %. Ступінь очищення цільового ферменту від баластних білків оцінено за допомогою електрофорезу в ПААГ у денатуруючих умовах за наявності SDS. Досліджено дію низки стабілізуючих агентів і умов зберігання, щоби забезпечити підтримання максимальної активності ФЦ b2. Найкращий стабілізуючий ефект спостерігали за використання 70 % амонію сульфату і зберігання препарату за температури –20 °С. Визначено деякі фізико-хімічні параметри очищеного ферменту з клітин O. polymorрha «tr1», зокрема: молекулярну масу і спектральні характеристики окисленої та відновленої форм ферменту.


Ключові слова


L-лактат: цитохром с оксидоредуктаза; Ogataea polymorрha; клітини надпродуцента; виділення; очищення; стабілізація ферменту

Повний текст:

PDF

Посилання


Ostapchenko L. I., Mykhailyk I. V. Biolohichni membrany: metody doslidzhennia struktury ta funktsii: navch. posibnyk. K.: VPTs «Kyivskyi universytet», 2006. 215 s.

Stasiuk N., Haida H., Haida A. ta in. Syntez afinnykh sorbentiv dlia ochyshchennia arhinazy I liudyny iz rekombinantnykh drizhdzhiv Hansenula polymorpha // Pratsi NTSh. Ser. Khemiia i Biokhemiia. 2011. T. 28. S. 139–149.

Ackland M. R., Reeder J. E. A rapid chemical spot test for the detection of lactic acid as an indicator of microbial spoilage in preserved foods // Appl. Bacteriol. 1984. Vol. 56. N 3. P. 415–419.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.1984.tb01369.x

Appleby C., Morton R. Lactic dehydrogenase and cytochrome b2 from yeast. Purification and crystallization // Biochem. J. 1959. Vol. 71. P. 492–499.

https://doi.org/10.1042/bj0710492

Bleiberg B., Steinberg J., Katz S. et al. Determination of plasma lactic acid concentration and specific activity using high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1991. Vol. 568. N 2. P. 301–308.

https://doi.org/10.1016/0378-4347(91)80167-B

Celerier J., Risler Y., Schwencke J. Isolation of the flavodehydrogenase domain of Hansenula anomala flavocytochrome b2 after mild proteolysis by an H. anomala proteinase // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 182. N 1. P. 67–75.

https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1989.tb14801.x

Crawford S., Hoogeveen R., Brancati F. et al. Association of blood lactate with type 2 diabetes: the Atherosclerosis Risk in Communities Carotid MRI Study // Int. J. Epidemiol. 2010. Vol. 39. N 6. P. 1647–1655.

https://doi.org/10.1093/ije/dyq126

Dmitruk K., Smutok O., Gonchar M., Sibirnyĭ A. Construction of flavocytochrome b2-overproducing strains of the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha (Pichia angusta) // Microbiology (Moscow). 2008. Vol. 77. N 2. P. 213–218.

https://doi.org/10.1134/S0026261708020100

Gaida G. Z., Stelmashchuk S. Ya., Smutok O. V., Gonchar M. V. A new method of visualization of the enzymatic activity of flavocytochrome b2 in electrophoretograms // Appl. Biochem. Microbiol. (Moscow). 2003. Vol. 39. N 2. P. 221–223.

https://doi.org/10.1023/A:1022558501487

Ichai C., Leverve X., Orban J.-Ch. Lactate and Acute Heart Failure Syndrome / in the Book Acute Heart Failure (Springer publishing. ISBN: 978-1-84628-781-7). 2008. P. 768–780.

Jacq C., Lederer F. Two molecular species of cytochrome b2 from Saccharomyces cerevisiae // Eur. J. Biochem. 1972. Vol. 25. N 1. P. 41–48.

https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1972.tb01664.x

Lowry O. H., Rosenbrough N. J., Farr A., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265–275.

Smutok O., Dmytruk K., Gonchar M. et al. Permeabilized cells of flavocytochrome b2 over-producing recombinant yeast Hansenula polymorpha as biological recognition element in amperometric lactate biosensors // Biosens. Bioelectron. 2007. Vol. 23. N 5. P. 99–605.

https://doi.org/10.1016/j.bios.2007.06.021

Shavlovskiy G. M., Zharova V. P., Shchelokova I. F. et al. Flavinogenic activity of natural strains of the yeast // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 1978. Vol. 14. N 2. P. 184–189.




DOI: http://dx.doi.org/10.30970/vlubs.2018.77.01

Посилання

  • Поки немає зовнішніх посилань.


Bookmark and Share