ЗАЛЕЖНІСТЬ АДАПТАЦІЙНОЇ ЗДАТНОСТІ МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ВІД СПОСОБУ ВИДІЛЕННЯ КЛІТИН
Анотація
Під час проведення досліджень на ізольованих гепатоцитах важливо отримати клітини, які зберігають функціональні властивості, характерні для цілісного органа. Підвищення у процесі перфузії печінки в’язкості крові, зменшення перфузійного тиску в судинах, а відтак і гіпоксія, належать до чинників, які можуть впливати на функціональний стан ізольованих гепатоцитів. Функціональний стан клітин можна оцінити за адаптаційною здатністю мітохондрій, індукуючи максимальну швидкість споживання кисню шляхом роз’єднання дихання і окисного фосфорилювання внаслідок додавання FCCP. Метою роботи було дослідити адаптаційну здатність мітохондрій ізольованих гепатоцитів з використанням перфузії печінки in situ та in vitro.
Гепатоцити ізолювали двостадійним методом Сеґлена, перфузуючи печінку in situ чи in vitro. Ізольовані гепатоцити, після 15 хв інкубації у середовищах без додавання або з відповідним екзогенним субстратом окиснення – глутаміном, піруватом, сукцинатом, монометил-сукцинатом, α-кетоглутаратом, диметил-α-кетоглутаратом (у концентрації 2 ммоль/л) або глюкозою (10 ммоль/л) – вносили у полярографічну комірку та додавали FCCP у наростаючих концентраціях.
Встановлено, що під час використання перфузії печінки in situ максимальні швидкості роз’єднаного дихання (найвище значення швидкості дихання за протестованих концентрацій FCCP) та оптимальні концентрації FCCP (за яких ці максимальні швидкості роз’єднаного дихання були зареєстровані) є вищими, ніж за перфузії печінки in vitro. Унаслідок додавання до середовища екзогенних субстратів швидкості дихання гепатоцитів збільшувалися. За перфузії печінки in vitro максимальна швидкість роз’єднаного дихання підвищувалась у всіх випадках, окрім використання глюкози, а у випадку перфузії in situ – лише коли застосовували диметил-α-кетоглутарат, сукцинат і монометил-сукцинат. Оптимальна концентрація FCCP за перфузії печінки in vitro зростала внаслідок додавання до середовища глутаміну, пірувату й монометил-сукцинату, а за перфузії in situ – лише за окиснення глюкози. За обох методів перфузії найвищу максимальну швидкість роз’єднаного дихання спостерігали за використання монометил-сукцинату, а оптимальну концентрацію FCCP – за окиснення пірувату.
Отже, перфузія печінки in situ є кращим методом отримання стабільних і метаболічно активних гепатоцитів для підтримання дихальних процесів на високому рівні, ніж перфузія in vitro.
Ключові слова
Повний текст:
PDFПосилання
Bellemann P., Gebhardt R., Mecke D. An improved method for the isolation of hepatocytes from liver slices. Selective removal of Trypan blue-dyeable cells // Anal. Biochem. 1977. Vol. 81. N 2. P. 408-415. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90711-4
Berry M., Wollenberg L., Zhao Z. Esterase activities in the blood, liver and intestine of several preclinical species and humans // Drug Metab. Lett. 2009. Vol. 3. N 2. P. 70-77. https://doi.org/10.2174/187231209788654081
Cassim S., Raymond V., Lapierre P., Bilodeau M. From in vivo to in vitro: Major metabolic alterations take place in hepatocytes during and following isolation // PLoS One. 2017. Vol. 12. N 12. P. e0190366. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0190366
Egnatchik R., Leamy A., Sacco S. et al. Glutamate-oxaloacetate transaminase activity promotes palmitate lipotoxicity in rat hepatocytes by enhancing anaplerosis and citric acid cycle flux // J. Biol. Chem. 2019. Vol. 294. N 9. P. 3081-3090. https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.004869
Gonçalves L., Vigário A., Penha-Gonçalves C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies // Malar J. 2007. Vol. 6. P. 169. https://doi.org/10.1186/1475-2875-6-169
Hayase K., Tappel A. Microsomal esterase of rat liver // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244. N 9. P. 2269-2274.
Kon S., Imai M., Inaba H. Isoflurane attenuates early neutrophil-independent hypoxia-reoxygenation injuries in the reperfused liver in fasted rats // Anesthesiology. 1997. Vol. 86. N 1. P. 128-136. https://doi.org/10.1097/00000542-199701000-00017
Lee D. H., Lee K. W. Hepatocyte isolation, culture, and its clinical applications // Hanyang Med Rev. 2014. Vol. 34. N 4. P. 165-172. https://doi.org/10.7599/hmr.2014.34.4.165
Manko B., Bilonoha O., Manko V. Adaptive respiratory response of rat pancreatic acinar cells to mitochondrial membrane depolarization // Ukr. Biochem. J. 2019. Vol. 91. N 3. P. 34-45. https://doi.org/10.15407/ubj91.03.034
Mazur H., Merlavsky V., Manko B., Manko V. Dependence of the mitochondrial adaptive capacity of hepatocytes on the oxidative substrates availability // Ukr. Biochem. J. 2019. Vol. 91. N 6. P. 5-14. https://doi.org/10.15407/ubj91.06.005
Morgan E., Yan B., Greenway D. et al. Purification and characterization of two rat liver microsomal carboxylesterases (hydrolase A and B) // Arch. Biochem. Biophys. 1994. Vol. 315. Iss. 2. P. 495-512. https://doi.org/10.1006/abbi.1994.1531
Moseley R., Jarose S., Permoad P. Hepatic Na+-dicarboxylate cotransport: identification, characterization, and acinar localization // Am. J. Physiol. 1992. Vol. 263. N 6. P. 871-879. https://doi.org/10.1152/ajpgi.1992.263.6.G871
Richert L., Binda D., Hamilton G. et al. Evaluation of the effect of culture configuration on morphology, survival time, antioxidant status and metabolic capacities of cultured rat hepatocytes // Toxicol In Vitro. 2002. Vol. 16. N 1. P. 89-99. https://doi.org/10.1016/S0887-2333(01)00099-6
Rognstad R. Gluconeogenesis in rat hepatocytes from monomethyl succinate and other esters // Arch. Biochem. Biophys. 1984. Vol. 230. N 2. P. 605-609. https://doi.org/10.1016/0003-9861(84)90441-7
Seglen P. Preparation of isolated rat liver cells // Methods Cell Biol. 1976. Vol. 13. P. 29-83. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(08)61797-5
Summermatter S., Santos G., Pérez-Schindler J., Handschin C. Skeletal muscle PGC-1α controls whole-body lactate homeostasis through estrogen-related receptor α-dependent activation of LDH B and repression of LDH A // Proc. Natl. Acad. Sci. 2013. Vol. 110. N 21. P. 8738-8743. https://doi.org/10.1073/pnas.1212976110
Underhill G., Khetani S. Bioengineered liver models for drug testing and cell differentiation studies // Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol. 2017. Vol. 5. N 3. P. 426-439. https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2017.11.012
Zimmerli B., O'Neill B., Meier P. J. Identification of sodium-dependent and sodium-independent dicarboxylate transport systems in rat liver basolateral membrane vesicles // Pflugers Arch. 1992. Vol. 421. N 4. P. 329-335. https://doi.org/10.1007/BF00374220
DOI: http://dx.doi.org/10.30970/vlubs.2020.82.16
Посилання
- Поки немає зовнішніх посилань.
